Anna được sinh ra ở Buda (nay là Budapest). Cái chết của Vladislaus II vào ngày 13 tháng 3 năm 1516 đã để lại cho cả hai anh chị em trong sự chăm sóc của Maximilian I, Hoàng đế La Mã thần thánh. Nó đã được sắp xếp rằng Anna kết hôn với cháu trai của mình, Đại công tước Ferdinand của Áo, con trai thứ hai của Nữ vương Juana của Castilla và người chồng quá cố và đồng cai trị của bà, Felipe I của Castilla. Anna kết hôn với Ferdinand vào ngày 26 tháng 5 năm 1521 tại Linz, Áo. Vào thời điểm Ferdinand đang cai quản vùng đất di truyền Habsburg thay mặt cho anh trai Charles V, Hoàng đế La Mã thần thánh. Nó đã được quy định rằng Ferdinand nên kế vị anh trai của Anna trong trường hợp ông chết mà không có người thừa kế nam.

Louis, anh trai của bà đã bị giết trong Trận Mohács chống lại Suleiman the Magnificent của Đế quốc Ottoman vào ngày 29 tháng 8 năm 1526. Điều này khiến cho ngai vàng của cả Bohemia và Hungary bị bỏ trống. Ferdinand tuyên bố cả hai vương quốc và được bầu làm Vua của Bohemia vào ngày 24 tháng 10 cùng năm, biến Anna thành Vương hậu của Bohemia.

Hungary là một trường hợp khó khăn hơn vì Suleiman đã thôn tính phần lớn đất đai. Ferdinand được một nhóm quý tộc tuyên bố là Vua Hungary, nhưng một phe quý tộc Hungary khác đã từ chối cho phép một nhà cai trị nước ngoài nắm giữ danh hiệu đó và bầu John Zápolya làm vua thay thế. Cuộc xung đột giữa hai đối thủ và những người kế vị của họ kéo dài đến năm 1571. Năm 1531, anh trai của Ferdinand, Charles V đã công nhận Ferdinand là người kế vị của mình với tư cách là Hoàng đế La Mã thần thánh, và Ferdinand được phong là Vua của người La Mã.

Anna và Ferdinand có mười lăm người con, tất cả đều được sinh ra ở Bohemia hoặc Hungary. Cả hai vương quốc này đã phải chịu đựng hàng thế kỷ từ những cái chết sớm giữa những người thừa kế và sự thiếu hụt triển vọng kế vị. Trong khi đó, Anna từng là nữ hoàng của Bohemia và là một trong ba nữ hoàng còn sống của Hungary cho đến khi bà qua đời ở Prague, vài ngày sau khi sinh con gái cuối cùng Joanna. Năm 1556, Charles V thoái vị và Ferdinand thành công với tư cách là hoàng đế, chín năm sau khi Anna qua đời.